Pásztázó lézeres konfokális mikroszkópia: pillantás a sejt mélyére

A molekulák sejten belüli helyzetének és mozgásának ismerete alapvetően fontos a sejtbiológiai jelenségek megértéséhez. A hagyományos mikroszkópia és kiváltképp a fluoreszcens mikroszkópia révén élő sejtekben is megfigyelhetők és jellemezhetők a molekulák közti kölcsönhatások („live cell imaging”). A pásztázó lézeres konfokális mikroszkóp (confocal laser scanning microscope, CLSM) mérföldkőnek számító képalkotó eljárás a technikai fejlődés folyamatában. Segítségével a megfigyelő három dimenzióban és igen nagy térbeli felbontással tanulmányozhatja a sejten belüli történéseket.

Működési elv

A pásztázó lézeres konfokális mikroszkópia alapelvét sematikusan az 1. ábra mutatja be. A pontszerű monokromatikus lézer fényforrás fényét az objektív a vizsgálandó minta adott síkjának egyetlen pontjába fokuszálja. A gerjesztett pontból emittált fény egy állítható méretű lyukra (pinhole, tűfok) fokuszálódik, majd a detektorba jut. Hagyományos fluoreszcens mikroszkópia alkalmazásakor nemcsak a fókuszsíkból, hanem a lejjebb vagy feljebb lévő síkokból származó fotonok is részt vesznek a képalkotásban, ezért a kép elmosódott. CLSM használata esetén a fókuszsíkon kívüli pontokból származó fotonok a „tűfok” segítségével kiszűrhetők, ezért élesebb képet nyerhetünk. Hogy ne csak egyetlen képpontról nyerjünk információt, egy elektromosan mozgatott tükör a lézert a fókuszsíkon belül pontról pontra vetíti, végigpásztázva a számunkra érdekes területet. A fókuszsík magassága a z tengely mentén (függőlegesen) változtatható. Több, egymáshoz közeli sík végigpásztázása után – számítógép segítségével – az eredeti háromdimenziós szerkezet is modellezhető. A hagyományos fluoreszcens mikroszkópiához képest a CLSM-et 1,4-szeres oldalirányú felbontóképesség és akár százszoros kontraszt jellemzi.

A minta festésének módját a kitűzött cél határozza meg. Fluoreszcens anyaggal megjelölhetünk például bizonyos sejteket egy sejtcsoportban, illetve egy adott sejten belül különböző sejtalkotókat, vagy akár kiszemelt molekulákat is.