A bakteriális meningitis gyors és pontos diagnosztikája

Brit kutatók a Chemical Science legújabb számában mutatják be kísérletsorozatukat, amelyben az úgynevezett felületerősített Raman-spektroszkópiával (SERS, surface enhanced Raman spectroscopy) egyszerre sikerült azonosítaniuk a bakteriális meningitis leggyakoribb kórokozóit. A DNS-szekvenálásra és az ezzel összekapcsolt fényszórás-mérésre épülő vizsgálóeljárás az agyi-gerincvelői folyadékban jelen lévő baktériumok mennyiségi meghatározására is alkalmas. A DNS-szekvencia diagnosztikai célú meghatározásra alkalmazott polimeráz-láncreakcióval (PCR, polimerase chain reaction) szemben a SERS legfőbb előnye a többféle kórokozó egyidejű, egymás melletti kimutatása, a DNS-beli „molekuláris ujjlenyomatok” spektroszkópiai megjelenítése révén. Emellett a SERS érzékenysége is nagyobb: segítségével akár pikomolnyi mennyiségű DNS-mintából is eredményesen azonosíthatók a kórokozók. További előnye, hogy nem igényli a komplex minta alkotóelemeinek előzetes szétválasztását.

A többlépcsős detektálási folyamat első lépéseként a kutatók a vizsgálandó baktérium DNS-ét tartalmazó elegyhez kétféle DNS-próbaszekvenciát adtak. A baktérium egyedi, ismétlődő szekvenciaelemeihez (az úgynevezett „molekuláris ujjlenyomatokhoz”) kötődni képes próbaszekvenciák egyikét fluoreszkáló festékmolekulával jelölték. Az egymást kiegészítő (komplementer) DNS-szakaszok megfelelő körülmények között egymással összekapcsolódtak (hibridizáltak), vagyis a baktérium DNS-ének kettős fonala megkötötte a próbaszekvenciákat. Ilyen módon lehetővé vált a baktérium módosított DNS-ének elválasztása az elegy többi összetevőjétől, a felesleges próbaszekvenciákat pedig eltávolíthatták a közegből.

A következő lépésben egy λ-exonukleáz nevű enzimet adtak a most már csak a módosított baktérium DNS-eket tartalmazó mintához. Ez rövid szakaszokra hasította és így leválasztotta a bakteriális DNS-ről a festékkel jelölt próbaszekvenciát. Ezután az elegytől elválasztott hasított próbaszekvenciát – amely tehát specifikus a bakteriális DNS-re és mennyisége azzal egyenértékű – egy ezüst nanorészecskéket tartalmazó oldattal elegyítették. Megfelelő reagensek hozzáadása esetén a nanoméretű fémrészecskék képesek magukhoz vonzani a DNS-szakaszokat, majd ők maguk is mintegy összecsapzódnak. Így a mintában a fluoreszkáló festékkel jelölt DNS-szakaszokat nagy koncentrációban tartalmazó gócpontok alakulnak ki. Ha ilyen állapotban megfelelő hullámhosszúságú lézerfénnyel sugározzák be a mintát, akkor a festékmolekulák fényszórása a mintában szabadon úszkáló molekulák fényszórásának sokszorosa (ez a felületi erősítés).

A Raman-spektroszkópiával detektált jelintenzitás pontos információt adott a DNS-próbaszekvenciával összekapcsolódott bakteriális DNS mennyiségéről. A kutatók hígítási próbákkal és számításokkal igazolták, hogy a kimutathatóság alsó határa a pikomolos koncentrációtartományba esik. E vizsgálatsorral külön-külön többféle baktérium minőségi és mennyiségi meghatározását is elvégezték. Ezután komplex minták vizsgálatában tesztelték az eljárás teljesítőképességét, és kimutatták, hogy a megfelelő próbaszekvenciák és több különböző fluoreszcens festék alkalmazásával lehetőség van a különféle kórokozók – nevezetesen a Neisseria meningitidis, a Streptococcus pneumoniae és a Haemophilus influenzae – DNS-ének egyidejű, egymás melletti minőségi és mennyiségi meghatározására.

Az akut bakteriális meningitis leggyakoribb kórokozói a Neisseria meningitidis, a Streptococcus pneumoniae és a Haemophilus influenzae, amelyek hagyományos kimutatása a betegséget okozó mikroorganizmus kitenyészésén alakul. Ez egyfelől időigényes (akár 36 óra is eltelhet a baktérium azonosításáig), másfelől lényeges hátránya, hogy beteg mintavételt megelőző antibiotikum szedése zavarhatja a kórokozó eredményes tenyésztését. Vélhetően ezzel magyarázható, hogy – az irodalmi adatok tanúsága szerint – a bakteriális meningitis feltételezett eseteinek nagy hányadában a tenyésztés végül nem igazolja a gyanút. E nehézségeket hidalják át a DNS-kimutatásra alkalmas eljárások – ilyen például a mikroorganizmus DNS-szekvenciáinak sokszorozására, majd ezt követő minőségi és mennyiségi meghatározására alkalmas PCR, ennek alkalmazásakor viszont a bakteriális DNS-maradványok zavaró hatásával kell számolni. Mivel a hatásos kezelés lényeges eleme az időfaktor, a kórokozó gyors és megbízható felismerésére alkalmas műszeres analitikai módszerek keresése napjainkban is időszerű probléma, amelynek megoldását segítheti az itt bemutatott felületerősített Raman-spektroszkópia.

Noha a széles körű klinikai alkalmazáshoz elengedhetetlen a megfelelő műszerekkel felszerelt laboratóriumi háttér, a kutatók úgy látják, a SERS diagnosztikai célú alkalmazásának elterjedése lehet a jövő útja. Mint mondják, jó alternatívája lehet a jelenlegi PCR-alapú diagnosztikai eljárásoknak, elősegítve bármilyen DNS-tartalmú mikroorganizmus – baktériumok, vírusok és gombák – által okozott fertőzés gyors és megbízható kórismézését. Emellett több olyan betegségről is említést tesznek közleményükben, amelyek diagnosztikájában már ma is kiaknázhatók a SERS nyújtotta lehetőségek. Ide sorolható a cisztás fibrózis, amelynek molekuláris genetikai diagnosztikájára elsőként alkalmaztak SERS eljárást a betegség kialakulásáért felelős gén (az aktív kloridtranszportot szabályozó transzmembrán fehérjét kódoló gén) mutációjának kimutatására. Egy másik hivatkozott közleményben a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) három különböző DNS-szekvenciájának egyidejű kimutatására alkalmaztak hasonló eljárást. A SERS rákdiagnosztikai alkalmazására – nevezetesen az emlőrák jellemző biomarkerének számító két gén egyidejű kimutatására – is van irodalmi példa.