A mikroglia lehetséges korrekciója Alzheimer-kórban
Úgy gondolják, hogy a mikroglia kulcsfontosságú szerepet játszik számos neurológiai rendellenesség, a többi között az Alzheimer-kór kialakulásában.
A Nature Neuroscience-ben egy nemrégiben megjelent cikkében a tudósok egy új szűrési platformot ismertettek, az Alzheimer-kórhoz (AD) kialakulásában feltételezett szerepe játszó specifikus mikroglia funkciókat szabályozó gének jellemzésére alkalmasak.
Az olyan szabályozó gének jellemzése, amelyek az AD-ben és más neurodegeneratív állapotokban szenvedő egyének agyában a mikrogliát egészséges állapotból beteg állapotba váltják át, segíthet az ezeket a géneket vagy az ezek által kódolt fehérjéket megcélzó terápiák kifejlesztésében.
A mikroglia szerepe
Az AD a demencia leggyakoribb formája, az összes demencia eset 60-80%-át teszi ki. E neurodegeneratív betegség kezelésére jelenleg nincs hatékony kezelési mód, annak ellenére, hogy egyer többet tudunk a hátterében húzódó pathológiai folyamatokról.
Az AD egyik jellemzője, hogy a térszerkezetében megváltozott béta-amiloid fehérje csomókká vagy plakkokká alakulva halmozódik fel. Kiterjedten kutatják azokat a mutációkat, amelyek a béta-amiloid fehérje rendellenességéhez és felhalmozódásához vezetnek. Ezen mechanizmusokat célzó kezelések azonban nem jártak sikerrel.
Azt is kimutatták, hogy egyes AD-ben szenvedőkben nem észlelhető az amiloid fehérje felhalmozódásával kapcsolatos gének mutációja. A legújabb bizonyítékok szerint az AD-ben szenvedőkben gyakran hiányoznak azok a mechanizmusok, amelyek a rosszul hajtogatott béta-amiloidokat eltávolítják. Ennek oka az agy elsődleges immunsejtjeinek, a mikrogliának a működési zavara lehet. A mikroglia egyik funkciója a fagocitózis –melynek során a mikroglia sejtek bekebelezik az elhalt sejteket, a kórokozókat és hibásan összehajtogatott fehérjéket, hogy megkönnyítsék eltávolításukat.
Egyre több bizonyíték van arra, hogy AD-ben a mikroglia béta-amiloid fehérje eltávolító funkciója károsodhat. A mikroglia az AD kialakulásához azáltal is hozzájárulhat, hogy gyulladásos fehérjéket választ ki, és túlzott mértékben távolít el neuronokat és az azok kapcsolatát biztosító és ezáltal kommunikációjukat lehetővé tévő szinapszisokat. Számos adat bizonyítja, hogy a mikroglia az AD mellett egyéb neurodegeneratív betegségek kialakulásában is szerepet játszik, azonban nem ismerjük a mikroglia normál működését, illetve a betegségekben játszót szerepét biztosító mechanizmusokat.
Hogyan segíthet a CRISPR technológia?
A funkcionális genetikai szűrés egy olyan eszköz, amelyet egy adott sejtfunkcióban részt vevő gének azonosítására használnak. Ennek során például gátolnak vagy aktiválnak egy specifikus gént egy adott sejtben, hogy felmérjék, az adott gén expressziós szintjének változása hatással van-e egy bizonyos funkcióra, például a sejtproliferációra.
Az elmúlt években a kutatók a CRISPR-Cas9 néven ismert génszerkesztő eszközt alkalmassá tették a különböző betegségekben, köztük a rákban szerepet játszó gének azonosítására. A CRISPR szűrési platform nagyobb érzékenységű és reprodukálhatósága is nagyobb a korábban használt szűrési módszerekénél.
A CRISPR-Cas9 egy kis RNS-darabból, úgynevezett vezetőszekvenciából és a Cas9 enzimből áll. A vezető RNS kötődik a kérdéses DNS-régióhoz, lehetővé téve a Cas9 enzim számára, hogy a DNS-t a megcélzott helyére kötődjön és elhasítsa a DNS-t a megcélzott helyen.
A jelen tanulmányban a kutatók egy módosított CRISPR-Cas9 rendszert használtak, amely egy deaktivált Cas9 (dCas9) enzimet tartalmaz, amely nem hasítja a DNS-t. A deaktivált Cas9 enzim mellett a módosított CRISPR-dCas9 platform olyan fehérjéket is tartalmaz, amelyek képesek fel- vagy leszabályozni a kérdéses gént – vagy más szóval ki- és bekapcsolni.
Az ilyen CRISPR-szűrések során az irányító RNS-t egy genetikailag módosított vírus segítségével juttatják a sejtbe. Azonban a vezető RNS-nek az érett mikrogliába történő eljuttatása a vírusok használata miatt nagy kihívást jelent.
Őssejtek használata
E nehézségek kiküszöbölésére a kutatók indukált pluripotens őssejteket (iPSC-k) használtak, amelyeket úgy állítanak elő, hogy szövetekből, például bőrből, hajból vagy vérből származó felnőtt sejteket embrionális állapotba programoznak át.
Az embrió őssejtjeihez hasonlóan ezek az iPSC-k bármilyen kívánt sejttípus, így neuronokat és a mikroglia sejtek kialakítására is képesek. Az iPSC-kből származó sejtek használatának előnye, hogy jobban hasonlítanak az emberi sejtekre, mint a hagyományos sejtvonalakra.
Az egerek és az emberek mikrogliái az immunválasz során különböznek molekulákat bocsátanak ki, így az emberi iPSC-kből származó mikroglia jobb modellt biztosít annak megértéséhez, hogy a gének hogyan szabályozzák a mikroglia funkciókat.
Jelen tanulmányban a kutatók indukált pluripotens őssejtvonalakat használtak, amelyeket úgy módosítottak, hogy kifejezzék a CRISPR-dCas9 gépezetet kódoló géneket. Az iPSC-kben lévő CRISPR „gépezet” azonban inaktív volt, és csak a trimetoprim antibiotikum jelenlétében lehetett aktiválni.
A kutatók ezután vírusvektorokat használtak az irányító RNS-ek iPSC-kbe juttatására. A felhasznált iPSC-ket genetikai mérnökséggel úgy alakították ki, hogy speciális táptalajon gyorsan differenciálódjanak, mikrogliaszerű sejtekké érjenek.
Az iPSC-k mikrogliasejtekké történő differenciálódása során a kutatók a CRISPR „gépezet” aktiválása érdekében trimetoprimt adtak a sejttenyésztő tápközeghez. Ez azt jelenti, hogy bár a tudósok bevitték a vezető RNS-eket az iPSC-kbe, a vezető RNS-ek által megcélzott gének csak azután aktiválódnak vagy gátolódnak, miután az iPSC-ket mikroglia-szerű sejtekké differenciálódtak.
Ha ezeknek a célzott géneknek az expressziója zavart szenved, az hátrányosan befolyásolhatja a mikroglia fejlődését. Ez megnehezítheti annak megkülönböztetését, hogy a célzott gének expressziójának változása vagy a felnőtt mikroglia működése befolyásolta-e a mikroglia fejlődését.
Ez az új CRISPR platform így lehetővé teszi a tudósok számára, hogy felmérjék a felnőtt mikroglia génfunkcióit.
Génjellemzés
A módosított CRISPR-szűrések validálása után a kutatóknak sikerült azonosítaniuk a mikroglia proliferációban, túlélésben, az immunválasz aktiválásában és a fagocitózisban részt vevő génjeit.
Azonosítottak például olyan géneket, amelyek modulálják a fagocitózist – azt a sejtfolyamatot, amely eltávolítja a neurodegeneratív rendellenességekben szerepet játszó potenciálisan toxikus részecskéket, például a PFN1-et és az INPP5D-t.
A mikroglia adaptívan reagál a helyi környezetére. Minden mikroglia állapotot (beteg, egészséges, immunválaszt kiváltó) egy specifikus génexpressziós profil jellemez.
A sejtek visszaterelése a helyes útra
A kutatók a különböző mikroglia állapotok jellemzésére egysejtszintű RNS-szekvenálást alkalmaztak. A génexpressziós profilok különbségei alapján a kutatók kilenc különböző mikroglia állapotot tudtak jellemezni. Az egyik funkcionális állapotot például az AD-ben és más neurodegeneratív állapotokban upregulált SPP1 gén fokozott expressziója jellemezte.
A gének expressziójának a CRISPR platform segítségével történő gátlásával a kutatók azonosítani tudták azokat a géneket, amelyek szabályozzák ezen funkcionális állapotok átvételét. Például azt találták, hogy a kolóniastimuláló faktor-1 receptor (CSF1R) gén CRISPR platform segítségével történő downregulálása csökkentette azoknak a sejteknek a számát, amelyek sok SPP1 gént expresszáltak.
Hasonló mikroglia-szám csökkenést figyeltek meg az SPP1-károsodással jellemezhető állapotban a CSF1R fehérjét gátló szert alkalmazásakor. A betegséget befolyásoló gének – vagy az ezek által kódolt fehérjék – célba vételével tehát visszaállítható a mikroglia egészséges állapota.
Az eredmények tanusága szerint ez a CRISPR-alapú platform felhasználható a neurodegeneratív állapotokhoz kapcsolódó mikroglia működéseket szabályozó gének azonosítására, ami a későbbiekben segítheti az ezeket a géneket vagy géntermékeket megcélzó kezelések kifejlesztésében.
Forrás:
