MOBE: új génszerkesztési eljárás

A Nature Biotechnology folyóiratban május 21-én jelent meg a University of California, San Diego kutatóinak cikke, amelyben egy új, igen hatékony génszerkesztési módszert ismertetnek, ez a MOBE (multiplexed orthogonal base editors). 

Az emberi genom körülbelül 3 milliárd bázispárból áll, és az emberek mindegyike 99,6%-ban azonos genetikai felépítésű. Ez a látszólag apró, 0,4%-os rész felelős az egyik és a másik ember közötti különbségekért. A bázispárokban található mutációk különleges kombinációi fontos nyomokat rejtenek a komplex egészségügyi problémák, köztük a szívbetegségek és az olyan neurodegeneratív betegségek, mint a szkizofrénia okairól. Az élő sejtekben a mutációk modellezésére vagy kijavítására szolgáló jelenlegi módszerek nem hatékonyak, különösen, ha multiplexeléssel - azaz több pontmutáció egyidejű létrehozásával – kellene elvégezni. A mostani fejlesztés eredménye, a MOBE egy olyan új genomszerkesztő eljárás, amelyekkel egyszerre több pontmutációt lehet létrehozni a genomban.

A kutatókat kezdetben különösen az érdekelte, hogy olyan genomokat hasonlítsanak össze, amelyek a DNS egyetlen betűjében különböznek egymástól – ezek a bázisokat jelölik: C (citozin), T (timin), G (guanin), A (adenozin). Ahol az egyik embernek C bázisa van, ott egy másik embernek T bázisa lehet. Ezek az SNV-k (single nucleotide variants) vagy egypontos mutációk. Egy személynek 4-5 millió variánsa lehet, és míg egyes variánsok teljesen ártalmatlanok, mások károsak lehetnek, és igen gyakran nem is egy variáns, hanem a variánsok valamilyen kombinációja okozza a betegséget.

A genom betegségmodellezésben való felhasználásának egyik problémája a lehetséges variációk puszta száma. Ha a tudósok azt próbálnák meghatározni, hogy mely genetikai mutációk felelősek a szívbetegségért, akkor meg tudnák fejteni egy olyan kohorsz genomját, amelynek mindegyike szívbeteg volt, de a két ember közötti variációk száma miatt nagyon nehéz meghatározni, hogy a variációk mely kombinációja okozza a betegséget.

“Van egy alapvető probléma a genetikai variánsok értelmezésével, mégpedig az, hogy a legtöbb, már azonosított variáns klinikailag nem minősített, ezért azt sem tudjuk, hogy patogén vagy jóindulatú” - nyilatkozta Quinn T. Cowan, a tanulmány első szerzője. “Ezért a célunk az volt, hogy egy olyan eszközt hozzunk létre, amelyet a betegségek modellezésében lehet használni egyszerre több variáns létrehozásával egy ellenőrzött laboratóriumi környezetben, ahol a variáns-kombinációkat tovább lehet tanulmányozni.”

A génszerkesztési eljárások fejlődése

Ahhoz, hogy megértsük, miért hozták létre a MOBE-t, fontos megértenünk jelenleg legszélesebb körben használt génszerkesztő eszköz, a CRISPR-Cas9 korlátait. A Charpentier és Doudna által kifejlesztett CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9 – rövid, fordított ismétlődésekkel elhatárolt szekvenciák genomi régiója/CRISPR-kapcsolt nukleáz 9) genomszerkesztő rendszer arra ad lehetőséget, hogy nukleotid-szinten lehessen a DNS-ben tárolt genetikai információt tetszőleges helyen, nagy hatékonysággal és pontosan módosítani. Ezért lett a CRISPR/Cas9 rendszer a genomszerkesztés precíziós svájci bicskája. A CRISPR-Cas9 eljárás egy rávezető (guide vagy tracer) RNS-t használ, amely úgy működik, mint egy GPS-jel: egyenesen odatalál a szerkeszteni kívánt lokációhoz. A Cas9 a DNS-hez kötődő enzim, amely a DNS mindkét szálát elvágja, így teljes törést végez. A genomszerkesztéshez használt Cas9 fehérje több mint 1350 aminosavat tartalmaz és hat különböző fehérjedoménből épül fel, amelyek téralkata, önszerveződése és hatékony együttműködése gyors és pontos. A HNH és a RuvC nevű két nukleázdomén óramű pontossággal hasítja ketté a felismert DNS-szakasznál a molekulát.

Bár viszonylag egyszerű műveletről van szó, a kettősszálú törések toxikus hatásúak lehetnek a sejtek számára. Ez a fajta génszerkesztés indeleket - véletlenszerű beillesztéseket (inzerciókat) és törléseket (deléciókat) - is eredményezhet, és ilyen esetekben a sejt nem képes tökéletesen megjavítani önmagát. Több gén CRISPR-Cas9-es szerkesztése pedig megsokszorozza a kockázatokat.

A CRISPR helyett Alexis Komor laboratóriuma egy saját fejlesztésű bázis-szerkesztési technikát használ, amely kémiai módosítást hajt végre a DNS-en, bár alkalmazásával egyszerre csak egyfajta szerkesztést (például C-ről T-re vagy A-ról G-re) lehet elvégezni. Tehát az olló helyett, amely egyszerre egy egész szakaszt vág ki, a bázis-szerkesztés egyszerre csak egy-egy betűt töröl és cserél. Ez jóval lassabb folyamat, de pontosabb és hatékonyabb, mivel kevésbé károsítja a sejteket.

Két vagy több bázisszerkesztő egyidejű alkalmazása (a C-t T-re cserélve a genom egyik helyén, és az A-t G-re egy másik helyen) lehetővé teszi a poligénes betegségek - azaz az egynél több genetikai variáns miatt előforduló betegségek - jobb modellezését. Nem létezett azonban olyan technológia, amely ezt hatékonyan, a rávezető (guide vagy tracer) RNS „crosstalk” nélkül tudta volna megtenni, ami akkor történik, amikor a bázisszerkesztők nem kívánt változásokat hajtanak végre.

A Quinn T. Cowan által kifejlesztett MOBE eljárás az aptamereknek nevezett RNS-struktúrákat használja - ezek kis RNS-hurkok, amelyek specifikus fehérjékhez kötődnek - arra a célra, hogy bázismódosító enzimeket toborozzon meghatározott genomi helyekre, lehetővé téve több hely egyidejű szerkesztését nagy hatékonysággal és a crosstalk kisebb gyakoriságával.

Ez a rendszer többek között azért újszerű, mert ez az első eset, hogy valaki aptamereket használt az ABE-k (adenozin bázisszerkesztők) és a CBE-k (citozin bázisszerkesztők) ortogonális mintázatban történő toborzására. A különbségek szembetűnőek: amikor a CBE és az ABE együttesen, nem MOBE-t használva adják be, a nemkívánatos “crosstalk” akár 30%-ban is előfordulhat. A MOBE használatával viszont a “crosstalk” aránya kevesebb, mint 5%.

A mostani tanulmány egy elvi bizonyíték a MOBE rendszer megvalósíthatóságának tesztelésére, amelyre a fejlesztők már ideiglenes szabadalmat kaptak. A további tesztelés érdekében a csapat több esettanulmányt végzett valós betegségekkel, köztük a Kallmann-szindrómával, egy ritka hormonális rendellenességgel, amelyet a nemi érés elhúzódása/hiánya és a szaglás hiánya/funkciócsökkenése jellemez. Az eredményekből kiderült, hogy a MOBE-rendszerek hatékonyan használhatók bizonyos poligénes betegségek meghatározó sejtvonalainak szerkesztésére.

„Jelenleg azon vagyunk, hogy a plazmidokat feltegyük az AddGene-re, hogy bárki szabadon hozzájuk férhessen. Reméljük, hogy más kutatók is használni fogják a MOBE-ket genetikai betegségek modellezésére, majd ezek segítségével remélhetőleg hatékony terápiákat hoznak létre a betegségek kezelésére” - nyilatkozta Cowan.

Írásunk az alábbi közlemények alapján készült:

A new gene-editing system tackles complex diseases

Development of multiplexed orthogonal base editor (MOBE) systems

Irodalmi hivatkozás:

Quinn T. Cowan et al, Development of multiplexed orthogonal base editor (MOBE) systems, Nature Biotechnology (2024). DOI: 10.1038/s41587-024-02240-0